[目的]构建混合谱系激酶结构域样（MLKL）基因敲除PK－15细胞株（PK-15 mlkl KO），研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒（PRV）复制的影响。[方法]根据MLKL序列设计特定的编辑位点。MLKL－sgRNA编辑载体由CRISPR／Cas9和基因编辑技术构建，并转染PK15细胞。多克隆细胞系在嘌呤霉素通过药物筛选获得，PK-15通过有限稀释法获得。PK15号细胞上MLKL基因的敲除水平通过目标基因组PCR、测序和Western　blotting进行验证。用reed-Muench法检测病毒增殖水平。PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。[结果]本实验成功构建了MLKL－sgRNA载体PK-15细胞系，并筛选出MLKL基因缺失647的bpPK-15细胞系，但在Western　blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15MLKL－KO细胞显著或显著增加了PRV GD wh（感染后36小时除外）和PRV　Bartha－K61的病毒滴度（P<0.01。P<0.05）。PRV-GD-wh和PRV　Bartha－K61感染PK-15 mlkl-Ko细胞后，坏死细胞明显减少。[结论]本研究构建了MLKL基因敲除PK-15细胞系。与PK-15细胞相比，PK-15 mlkl Ko细胞显著提高了PRV GD wh和PRV　Bartha－K61的复制和存活能力，为PRV　Bartha－K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了可行的策略。